摘要：为开发利用桑叶,提高其附加值,以桑叶提取液的抗氧化性为指标,分别分析比较了传统热水浸提法和加酶浸提法对桑叶生理活性成分的提取方法;并在此基础上研究了桑叶提取物的抗氧化稳定性,确定了桑叶饮料的制备工艺,同时还研究了桑叶饮料储藏环境对其货架期的影响。结果表明不同的提取方法对桑叶饮料的抗氧化性能有明显的影响,与传统热水浸提方法相比采用加酶浸提法提取桑叶活性成分更加高效,提取效果更好。桑叶生理活性成分加酶浸提的最佳提取条件为:料液比为1︰30(g/mL),纤维素酶浓度2.0%,50℃下提取50min。桑叶饮料最佳调配工艺条件为:蔗糖5%、柠檬酸0.2%、VC0.04%。桑叶饮料室温下的货架期为90d左右。

关键词：桑叶;生理活性成分;提取方法;饮料调配

桑叶在我国有丰富的资源，传统的桑叶只用于养蚕，用途单一，每年有大量桑叶过剩而浪费，特别是晚秋桑叶利用率低。随着农产业产业结构的调整以及国际蚕丝贸易的影响，蚕桑业的整体形式不容乐观。桑叶中丰富的营养成分以及生物活性成分，决定了它的营养药用价值。随着人们对桑叶研究及认识的深入，桑叶作为调节生理、维护健康、增强体质的食品越来越受人们的欢迎，桑叶有望成为一些疾病尤其是老年性疾病的重要治疗药品及功能性食品，目前还未开发出桑叶系列保健品种及功能性饮料。寻找桑叶的多用途开发渠道，既可以充分利用自然资源，又可以为蚕桑业找到新的经济增长点，推动蚕桑业发展，桑叶饮料具有可观的发展前景。

1.1试验材料

桑叶（干燥），购自上海跃进食品有限公司；试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂上海有限公司。

1.2仪器与设备

JY型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；HHS-21-4型电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司；DZF-型真空干燥箱：上海圣科仪器设备有限公司；数显鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司；FD-1D-80型冷冻干燥机：南京以马内利仪器设备有限公司；GDYQ-S型过氧化值测定仪：长春吉大仪器有限责任公司；WX-型微波消解仪：上海屹尧仪器科技有限公司；S型可见光分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1工艺流程

桑叶干燥→粉碎过筛→加酶浸提→过滤→滤液备用→物料混合→调配→均质→灌装→排气杀菌→冷却→成品

1.3.2样品预处理

新鲜桑叶自然晾晒，风干，用组织粉碎机粉碎，并过60目筛，真空包装后放干燥处备用。

1.3.3桑叶成分测定

水分含量测定：恒重法。

1.3.4过氧化值的测定

取样品0.5～1g、碘应用液1.0mL，分别置于25mL比色管中，同时做一试剂空白管。每管内加入氯仿与冰醋酸（1∶1）混合液10mL，饱和碘化钾溶液1.0mL，密塞混匀后，暗处静置3min，取出，加蒸馏水至25mL，混匀，静置分层。取上层澄清部位溶液，在波长nm处，用试剂空白液调零，测样品和标准液吸光度。计算公式如下：

1.3.5感官评定

感官检验是通过观察食用油的色泽、透明度、气味及品尝等方法，初步判断油的品质[1]。采用的感官评价方法是按照GB/T—[2]分别进行油脂的透明度检验、色泽鉴别、以及气味和滋味评定。

2.1干燥桑叶水分含量

由表1可知，试验所用桑叶水分含量为2.45%，远远低于安全水分含量5%，这样的桑叶有利于长期保存，而且其有效成分在加工中能很好的释放出来[4]。

表1桑叶水分含量测定

样品水分含量/%桑叶2.45

2.2桑叶中生理活性物质的热水浸提法研究

2.2.1料液比对桑叶中生理活性物质抗氧化活性的影响

在不同的料液比下，桑叶中活性成分的释放会有所差异，提取速度和提取的完全程度也会产生区别；而且料液比不同，原材料的利用率也会不同，分别考察不同料液比（1︰10，1︰20，1︰30，1︰40和1︰50（g/mL））条件下提取液对抗氧化效果的影响。所得结果见图1。

由图1可以看出，随着料液比的增大，油脂的过氧化值也随之增大，所以桑叶提取液的抗氧化效果亦随之减弱，分析原因可知，当料液比增大时，提取液中抗氧化活性成分的浓度也随之降低，所以其抗氧化效果会下降。但若料液比采用1︰10（g/mL）的条件，结合实际可知，此条件下提取液浓度太大，不利于后续提取操作的进行，而且所得提取液色泽太深，产量太少，浪费原料严重，此外李勇等在对桑叶功能性成分研究时，料液比采用1︰20（g/mL）作为提取条件[5]，因此综合考虑，料液比可以考虑定为1︰20或1︰30（g/mL）的条件，此条件下，提取液有很好的抗氧化性能，而且提取过程方便易于操作原料利用率也较高。

图1提取料液比对抗氧化效果的影响

2.2.2提取温度对桑叶中生理活性物质抗氧化活性的影响

温度会对桑叶活性成分的提取速率产生明显的影响，而且功效成分的活性也会受温度改变而有较大的波动，设计抗氧化性单因素试验的方案，分别考察在不同温度（50℃，60℃，70℃，80℃和90℃）条件下提取液对抗氧化效果的影响。所得结果见图2。

由图2可知，提取温度对桑叶提取液抗氧化性质有着明显的影响。在50℃～80℃之间时，随着温度的升高提取液的抗氧化特性越来越好，原因可能是，随着温度逐渐升高，桑叶中的活性成分物质得以充分的释放，温度如果太低，活性成分显然不能很好的被浸提出来，但是并非温度越高越好，当温度高于80℃左右时，提取液的抗氧化特性反而会随之减弱，可能是由于温度如果太高，活性成分就会遭到破会，抗氧化性能随之减弱。所以浸提的适宜温度应该在80℃左右为宜。

图2提取温度对抗氧化效果的影响

2.2.3提取时间对桑叶中生理活性物质抗氧化活性的影响

一般随着时间的增长，要提取的有效成分会慢慢渗入到溶剂里，并且随着时间的延长达到一定的值不再增长，选择合适的提取时间不仅会缩短操作周期，也会对活性成分的活性有很好的保护。设计抗氧化性单因素试验的方案，展开试验，分别考察在不同提取时间（40，50，60，70和80min）条件下提取液对抗氧化效果的影响。所得结果见图3。

由图3时间抗氧化特性曲线分析可知，提取时间对桑叶提取液抗氧化性质同样也存在影响，一开始的时候，随着提取时间逐渐增加，过氧化值也随之降低，即抗氧化效果越来越好，分析原因可知，当浸提时间慢慢增长时，桑叶中的活性成分会慢慢溶解到提取液里，这是一个缓慢的过程，需要一定的时间，随着活性成分的慢慢累积，其抗氧化特性必然会提高。当活性成分基本完全释放出来后，再继续浸提，活性成分长时间和空气接触，可能会遭到破坏，所以抗氧化性稍有下降，因此浸提时间应控制在60min左右。

图3提取时间对抗氧化效果的影响

2.2.4正交优化试验

综合上述试验结果，正交试验优化试验方案，在单因子试验的基础上进行正交试验，优化提取工艺。选择料液比、提取温度和提取时间3个因素，按L9(33)设计三因素三水平试验，分析正交试验条件下提取液对抗氧化效果的影响。结果见表2。

所得试验结果列入表3。

通过单因素试验的基础上，进行正交试验，分析正交试验条件下提取液对抗氧化效果的影响。结合表2和表3综合分析，看每一个因素对各指标的影响。一般地说，各列的极差是不同的，这说明各因素的水平改变时对试验指标的影响是不同的。极差越大，说明这个因素的水平改变时对试验指标的影响越大。极差最大的那一列，则那个因素的水平改变时对试验指标的影响就最大，那个因素就是我们要考虑的主要因素。从表2算出3列的极差分别为0.，0.和0.。显然第2列即因素B的极差0.最大。这说明因素B的水平改变时对试验指标的影响最大，因此因素B是我们要考虑的主要因素。综合来看它的第2水平所对应的过氧化值数值较低，所以取它的第2水平最好。第1列即因素A的极差为0.，仅次于因素B，且第1水平所对应的过氧化值数值较低，即抗氧化效果较好，所以取它的第1水平最好。第3列即因素C的极差为0.，是3个因素中极差最小的，说明它的水平改变时对试验指标的影响最小，且因素C第2水平所对应的过氧化值数值较小，所以取它的第2水平最好。从以上分析可以得出结论：各因素对试验指标（抗氧化性）的影响按大小次序来说应当是B（温度）、A（料液比）、C（时间）；最好的方案应当是B2A1C2，即料液比1︰20（g/mL），提取温度80℃，提取时间60min。可以对最有试验方案做验证试验，验证试验结果为过氧化值6.7，说明所得试验理论结果是可靠的。

表2正交试验因素水平表

水平因素A料液比/(g·mL-1)B温度/℃C时间/min11︰︰︰

表3正交试验结果分析表

主次水平B＞A＞C

2.3桑叶中生理活性物质的酶解法研究

2.3.1纤维素酶浓度对桑叶中生理活性物质抗氧化活性的影响

酶工程现在已经得到了越来越多的应用，在不同的领域发挥着越来越重要的作用，有酶催化的体系反应更加迅速，提取效率更高，能够节约大量的时间和成本。抗氧化性单因素试验的设计方案，展开试验分别考察不同纤维素酶浓度（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%）对抗氧化效果的影响。所得结果见图4。

由图4可知，其他条件一定时，随着酶浓度的增大油脂过氧化值随之逐渐减小，说明抗氧化性随之增强，分析原因可知，在酶浓度在0.5%～1.5%范围内时，随着酶浓度的升高，抗氧化性随之提高；酶浓度升高到一定程度后再提高酶浓度，抗氧化性趋于平缓。分析出现这种情况的原因，是由于底物量一定，当底物反应完全后，再提高酶浓度不会增加活性成分的含量。因此反应酶浓度设为1.5%条件下较为合适。

图4纤维素酶浓度对抗氧化效果的影响

2.3.2料液比对桑叶中生理活性物质抗氧化活性的影响

图5料液比对抗氧化效果的影响

抗氧化性单因素试验的设计方案，分别考察不同料液比（1︰10，1︰20，1︰30，1︰40和1︰50（g/mL））条件下提取液对抗氧化效果的影响。所得结果如图5。

由图5料液比抗氧化特性曲线可知，随着料液比的增大，油脂的过氧化值也随之增大，所以桑叶提取液的抗氧化效果亦随之减弱。这一点和热水浸提法基本相同，分析原因，当料液比增大，提取液中抗氧化活性成分的浓度也随之降低了，所以其抗氧化效果自然下降。综合考虑，料液比可以考虑为1︰20或1︰30（g/mL）时，既能保证提取液有很好的抗氧化性能，又利于提取过程的操作，节约原材料和成本。

2.3.3提取温度对桑叶中生理活性物质抗氧化活性的影响

抗氧化性单因素试验的设计方案，分别考察不同温度（30℃，40℃，50℃，60℃和70℃）条件下提取液对抗氧化效果的影响。所得结果如图6。

由图6分析可知，在30℃～50℃温度范围内，随着提取温度的升高，过氧化值随之减小，说明抗氧化性有所提高；温度升高到一定程度后再提高提取温度，过氧化值降低到一定程度后开始上升，即抗氧化效果随提取温度的升高而下降。出现这种情况的原因，可能是由于纤维素酶有适宜的催化温度，高温会使酶的活性降低，从而抗氧化性降低[6]。杨海霞等在做桑叶多糖酶解法提取试验时温度设定为50℃左右[7]，所以研究设定酶解提取温度为50℃是合理的。

图6提取温度对抗氧化效果的影响

2.3.4提取时间对桑叶中生理活性物质抗氧化活性的影响

图7提取时间对抗氧化效果的影响

抗氧化性单因素试验的设计方案，分别考察不同提取时间（20，30，40，50和60min）条件下提取液对抗氧化效果的影响。所得结果见图7。

由图7时间抗氧化特性曲线分析可知，酶解提取法提取时间相对于热水浸提法有所缩短，这也正是酶催化作用的高效性[8]。催化开始的时，随着提取时间逐渐增加，过氧化值也随之降低，分析可知，当浸提时间慢慢增长时，桑叶中的活性成分的溶解是一个缓慢的过程，需要一定的时间，当浸提时间达到40～50min左右时，活性成分基本完全释放出来后，随着活性成分的慢慢累积，其抗氧化特性必然会提高[9]。再继续浸提，活性成分长时间和空气接触，活性会受到影响，所以抗氧化性稍有下降，因此加酶浸提时间应控制在40min左右。

2.3.5酶解法正交优化试验

综合上述试验结果，在单因子试验的基础上进行正交试验，优化提取工艺。选择料液比、提取温度、提取时间和酶浓度4个对抗氧化性影响较大的因素，设计四因素三水平试验。分析正交条件下各组抗氧化效果，结果见表4。

表4纤维素酶正交试验因素水平表

水平因素A料液比/(g·mL-1)B温度/℃C时间/minD酶浓度/%11︰.︰.︰.0

所得试验结果及分析见表5所示。

从表5中的极差看出，因素D即酶浓度的极差最大，为0.，因此因素D对试验结果的影响最大，且从表中可以看出，因素D取第2水平时抗氧化效果最好；其次是因素A，它的极差值达到0.仅次于因素D，说明因素A对试验结果同样也会有较大的影响，综合来看当因素A取第2水平为好；此时的抗氧化性较其它水平条件下较好；再者是因素C，因素C的极差达到0.，取第2水平时效果最好；因素B的影响最小，极差仅为0.，对试验结果的影响远小于前三者，取第2水平为好。

表5纤维素酶L9(33)正交试验结果

试验号ABCD过氧化值/mmol·kg-1.........4k16....k25....k36...6.R0.0..0.优方案A2B2C2D3主次顺序D＞A＞C＞B

总之，这个试验的最优方案应当是A2B2C2D3。即料液比为1︰30（g/mL）、温度为50℃、时间为50min、酶浓度为2.0%；和热水浸提方法相比较可知，酶解法提取时间更短即提取效率有所提高，提取温度更加温和，操作起来更加便捷。

但是这个方案在正交试验做过的9组试验中是没有的。可以按这个方案再试验一次，看是否会得到更好的结果，从而确定出最优方案。验证试验见表6。

由表6所做验证试验可知，验证试验提取液有很好的抗氧化效果，由此分析，所得试验结果可靠，即最佳的提取条件应该选择料液比为1︰30（g/mL），温度为50℃，时间为50min，酶浓度为2.0%。

表6饮料提取条件验证试验结果

过氧化值/mmol·kg-︰.05.8试验号A料液比/(g·mL-1)B温度/℃C时间/minD酶浓度/%

2.4桑叶饮料的调配

2.4.1饮料调配的正交试验

查阅相关资料[10-11]可知，影响本次试验饮料口感的主要因素为蔗糖浓度、柠檬酸浓度和VC浓度，为了探究这3个因素对饮料口感的影响，采用L9(33)正交试验，以感官评价为指标，分别从色泽、均一度、香味、口感3个方面评价，由此选出最佳配比，然后进行调配。正交试验分析结果见表7。

表7饮料调配正交试验因素水平表

水平因素A蔗糖含量/%B柠檬酸含量/%CVC添加量/%.10..20.60.30.04

表8饮料调配L9(33)正交试验结果分析表

试验号ABC感官评定213k.15..k.16..k...R3.1..优方案A2B2C3主次顺序A＞B＞C

正交试验结果及分析见表8。

由表8的试验结果分析可知：因素A的极差最大为3.0，故因素A对桑叶饮料的口感影响最大，且综合来看当因素A取水平2时感官评定的得分最高。其次是因素B，其极差仅次于因素A，当取其第2因素水平时口感也较好；对口感影响最小的是因素C，其极差仅为0.，说明VC的用量对饮料的口感上作用不大，因此综合来看，最优的饮料调配条件为A2，B2和C3。即蔗糖含量5%，柠檬酸含量0.2%，VC含量0.04%。这组条件刚好出现在试验5里面，可以对此做验证试验。

2.4.2饮料调配的验证试验

故以正交试验中最佳的5号组合条件A2B2C3作为研究对象，再次确定调配的最佳复配组合。结果见表9。

由表9可知，验证试验的感官评定得分仍然能够达到18分，说明正交试验的结果是可靠的，即最佳调配组合为蔗糖5%、柠檬酸0.2%、VC0.04%。

表9饮料调配的验证试验

试验号A蔗糖含量/%B柠檬酸含量/%CVC添加量/%感官评定/分.20.

2.5货架期试验

通过破坏性试验，即分别将饮料样品放置在4℃、室温、37℃，观察桑叶饮料的组织状态、色泽、香味、口感的变化，以获得山药饮料的货架期。结果如表10。

由表10试验结果可知，以4℃放置的饮料作为参照标样；饮料在37℃环境下放置3d后，桑叶饮料色泽变深褐色，开盖有明显异味，再存放1d后腐败更严重，无法饮用故停止试验。由此推算保质期约为3个月；室温环境下放置下30d后出现色泽仍然正常。综合上述，判定此饮料的货架期为3月左右，即约90d。

表10货架期试验结果

时间/h储存条件4℃室温37℃1正常正常正常6正常正常正常12正常正常正常24正常正常开始有少量沉淀36正常正常有些许沉淀48正常正常颜色暗淡,有沉淀60正常正常颜色加深,沉淀增多72正常开始有沉淀开始有异味84有少量沉淀有少量沉淀颜色暗淡,有异味96有少量沉淀有少量沉淀强烈异味感,无法食用

经过研究，课题得到以下结论：

1)试验所用桑叶的水分含量为2.45%。远远低于安全水分含量5%，此条件下最适宜密封贮存，这样桑叶中的有效成分才能在加工中很好的释放出来。

2)热水浸提法提取桑叶活性成分的最佳提取条件为：即料液比1︰20（g/mL），提取温度为80℃，提取时间为60min。

3)纤维素酶解提取法提取桑叶活性成分的最优方案应当是料液比为1︰30（g/mL），温度为50℃、时间为50min、酶浓度为2.0%。

4)比较热水浸提法和纤维素酶解提取法，提取桑叶活性成分可知，酶解法提取活性成分所用时间更短，即提取效率更高，提取温度更加温和，更加便捷。

5)最优的饮料调配条件为蔗糖含量5%，柠檬酸含量0.2%，VC含量0.04%。

6)由保藏试验判断，此饮料的货架期为3个月左右，即约90d。

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